Вводная часть протокола. Наследственные болезни нервной системы (НБНС) – это заболевания, передающиеся из поколения в поколение или через поколение, обусловленные генными или хромосомными мутациями. При хромосомных мутациях в одних случаях различают нарушение числа хромосом (удвоение, утроение, отсутствие) или имеет место нарушение структуры хромосомы (делеции, инверсии, транслокации, дупликации). При генных мутациях изменения наблюдаются соответственно в генах на определенных участках хромосом. Мутации могут включать или одну ДНК последовательность (простые мутации) или обмены между аллельными или неаллельными ДНК-последовательностями. Эти изменения являются молекулярной причиной моногенных заболеваний – довольно разнородной по клиническим проявлениям группы болезней. Наличие выраженного фенотипического полиморфизма приводит к различным клиническим признакам у представителей даже одной семьи. Неврологическая симптоматика может быть представлена классическими развернутыми формами, разнообразными атипичными проявлениями и «стертыми» клиническими симптомами. При изучении распространенности и исходов тяжелых прогрессирующих НБНС нами было показано, что до определенного времени эти пациенты являются достаточно компенсированными и абсолютно здоровыми людьми и болезнь у них дебютирует в самые разные периоды их жизни (в детском или пубертатном периоде или в возрасте от 35 до 60 лет) в результате разных этиопатогенетических факторов.
Основные надежды при лечении НБНС и НБД возлагаются в будущем на технологии генного редактирования. Целью генного редактирования является удаление патологического гена из генома клетки и его замена на нормальный. Как можно отредактировать миллиарды поврежденных клеток нервной ткани в головном мозге и остановить болезнь? Пока представить сложно. И что делать сегодня, когда НБНС вдруг, во взрослом возрасте, начинает быстро и неуклонно прогрессировать, что ведет к глубокому слабоумию, тяжелой инвалидизации или возникновению различных форм рака и других злокачественных новообразований? Очевидно, что до «светлого будущего» геномного редактирования в клинической практике дожить многим из этих пациентов будет достаточно проблематично!
Мы предлагаем рассмотреть альтернативу генному редактированию – инновационную технологию «геномного балансирования» в виде ex vivo генотерапии, основанной на использовании подходов персонализированной медицины, геномной и постгеномной медицины и известных медицинских инновационных технологиях и лекарствах, разрешенных к клиническому применению в Российской Федерации.
Целью персонифицированной ex vivo генотерапии не является излечение пациента от НБНС или нейродегенеративных болезней (НДБ), а целью данного лечения становится предотвращение их прогрессирования, профилактика рецидивов болезни и борьба с фатальными (онкологическими, аутоиммунными, сердечно-сосудистыми и нейродегенеративными и др.) осложнениями приводящими к смерти и тяжелой инвалидизации. Персонифицированная ex vivo генотерапии НБНС или НДБ это шанс остановить болезнь, но только в том случае, если наши генетики смогут реставрировать ДНК- повреждения в собственных гемопоэтических (кроветворных) стволовых клетках (ГСК) пациента in vitro и подобрать условия их ex vivo реставрации. Далее проводится реинфузия реставрированных ГСК пациенту в условиях иммуносупрессии собственного гемопоэза. Это первый и основной этап терапии. Следующий этап лечения предполагает клеточную терапию реставрированными аутологичными или здоровыми донорскими ГСК, реабилитацию и терапию лекарственными средствами , что бы попытаться восстанавливать причиненные болезнью разрушения нервной ткани в головном и спинном мозге пациента и создавать новые функции мозга.
Требования к включению в протокол. В протокол включаются только пациенты с молекулярно-генетически подтвержденным наследственным заболеванием, диагностированным в специализированном федеральном медицинском учреждении. Главное требование к участию в данном протоколе – доказанное клиническое прогрессирование или рецидив наследственной генетической болезни и наличие риска фатальных осложнений или когнитивных нарушений. В большинстве случаев, прогрессирования НБНС формируется лавинообразное нарастание дегенеративно-атрофических процессов в различных участках центральной нервной системы (ЦНС), приводящих к глубокой деменции при атрофии коры мозга, тяжелой атаксии при атрофии коры мозжечка, акинетико-ригидных расстройствах и дискинезий при дегенерации стриопалидарной зоны мозга или атрофии мышц при повреждении моторных нейронов. В ряде случаев, декомпенсация приводит к глубокой инвалидизации из-за аутоиммунных нарушений или даже к летальному исходу из-за возникновения онкологических или сердечно-сосудистых осложнений. Эти витальные осложнения обусловлены в первую очередь формированием геномно-протеомных структурных нарушений (делеции, инверсии, транслокации, дупликации) в дифференцированных специализированных клетках органов и тканей и как следствие повреждений и разрывов ДНК в них. Эти повреждения ДНК являются причиной накопления патоспецифических (онкоспецифических, кардиспецифических, нейроспецифических и т.д.) белков (ПСБ) в них и формированию «неустойчивости» генома этих клеток. Горизонтальный и вертикальный обмен ПСБ пострадавших специализированных клеток с иммуннокомпетентными клетками и гемопоэтическими (кроветворными) стволовыми клетками (ГСК), приходящими в патологический очаг в тканях на «градиент воспаления», приводит в последних к активации генов клональности и формированию патологических клонов собственных ГСК пациента. Олигоклональный гемопоэз или другими словами патологическое кроветворение, определяемое одним или двумя клонами геномно-протеомно-измененных ГСК у пациентов с НБНС и НДБ и есть главная причина декомпенсации их состояния и прогрессирования болезни, так как именно он поддерживает неустойчивость генов в пострадавших специализированных дифференцированных клетках и появлению в них дополнительных мутаций генов и формированию патоспецифической иммунной недостаточности. Именно патологическое олигоклональное кроветворение приводит к глубокой инвалидности, деменции или летальному исходу в результате аутоиммунного воспаления, дегенерации нервной ткани или канцерогенного перерождения тканей пациента с НБНС. Таким образом, причиной прогрессирования болезни и возникновению декомпенсации пациента с НБНС является наличие постоянной «нестабильности генома» пострадавших дифференцированных клеток органов и тканей за счет формирования патологического олигоклонального кроветворения. И это главные молекулярно-биологические мишени и цели предлагаемой генотерапии данного протокола.
Нозологии болезней.Наследственные системные дегенерации нервной системы: заболевания с поражением мозжечка, сочетанные дегенерации мозжечковых путей и периферических нервов, болезни с преимущественным поражением экстрапирамидной системы: болезнь Паркинсона, гепато-церебральная дистрофия, хорея Гентингтона, семейный эсенциальный тремор Минора, генерализованный тик, деформирующая мышечная дистрофия. Болезни с преимущественным поражением пирамидных путей: семейный спастический паралич Штрюмпеля, семейный боковой амиотрофический склероз.
Научное обоснование. Особая актуальность данной проблемы обусловлена отсутствием эффективных методов лечения прогрессирования НБНС и существующей возможностью повторных случаев в последующих поколениях. Основные надежды при лечении НБНС возлагаются в будущем на технологии геномного редактирования. Но что делать сегодня если заболевание неуклонно прогрессирует? Можно ли его остановить? Да, можно и ответ на эти вопросы дали наши экспериментальные работы по реставрации смертельных мутаций поврежденных ГСК с использованием природоподобной технологии гомологичной рекомбинации (равнозначной замены) мутантных участков ГСК на двухцепочечную ДНК (дцДНК) здорового донора. Молекулярные исследования по реставрации смертельно поврежденных ГСК и МССК с большим количеством мутаций и повреждений ДНК, обусловленных 3-5 кратной фатальной дозой ионизирующего облучения позволило создать природоподобную революционную инновационную биотехнологию реставрации и замены мутантных участков ДНК на подобные участки здоровой донорской ДНК в процессе деления ГСК больного с НБНС. Результаты работы подтверждены доклиническими исследованиями на трансгенных моделях животных с наследственной болезнью Альцгеймера и бокового амиотрофического склероза.
При изучении распространенности и исходов тяжелых прогрессирующих НБНС нами было показано, что до определенного времени эти пациенты достаточно компенсированы, живут и функционируют в на производстве, семье и социуме как абсолютно здоровые люди и болезнь у них дебютирует в самые разные периоды их жизни (в младенческом, детском или пубертатном периоде или вообще в возрасте от 35 до 60 лет и позже). У этих пациентов в результате наследуемых генетических стигм формируются определенные фенотипические (внешние) изменения организма и специфические неврологические симптомокомплексы, но это не мешает им полноценно жить и надежно функционировать их органам и тканям. То есть, в большинстве случаев всех НБНС наличиеврожденного генетического дефекта в каждой клетке организмау каждого больного не мешает нормально жить пациенту и быть полноправным членом общества, даже при наличии молекулярно-генетически доказанной наследственной патологии.
До определенного времени наличие молекулярно-генетических признаков наличия НБНС не влияет на социальную и трудовую активность человека и не приводит к их социальной дезадаптации, а также не ведет к неизбежному и неотвратимому смертельному исходу, слабоумию, атаксии или глубокой инвалидизации и не возможности самообслуживания из-за наличия генетического факта болезни. Более того, в ряде случаев, наличие НБНС может вообще не дебютировать болезненными проявлениями и человек не подозревает о его наличии у себя! Однако, есть достаточно большой контингент пациентов, которые знают о своей патологической семейной наследственности определенной НБНС, но абсолютно не знают как обезопасить себя и своих детей и родственников от возможных проблем в будущем. Другими словами, наличие различного типа хромосомных структурных изменений (делеций, инверсий, транслокаций, дупликаций в хромосомах) или наличие наследственно приобретенных различных генетических мутаций, обусловленных разрывами и повреждениями ДНК в принципе не является приговором к близкой смерти, инвалидности или слабоумию, так как их геном находится в «стабильном состоянии» и обеспечивает нормальное функционирование всех клеток и тканей организма! Основной причиной прогрессирования НБНС, приводящей к глубокой инвалидности или летальному исходу является «декомпенсация их клинического состояния», молекулярно обусловленная внезапно возникшей «нестабильностью генома» собственных дифференцированных тканеспецифичных клеток. Причиной декомпенсации может быть психологический стресс, травмы, ионизирующая радиация, канцерогенные факторы, неправильное питание, лекарственная интоксикация и еще сотни разных экзо- и эндогенных факторов. Все проблемы у пациентов с НБНС возникают именно при декомпенсации их соматического состояния, что ведет к неукорнному прогрессированию болезни и главная цель врача- невролога остановить процесс прогрессирования и рецидива болезни.
Научные понятие «компенсация» и декомпенсация» болезни очень хорошо известны и понятны врачам разных специальностей, когда они обсуждают на консилиумах этиопатогенез и клинические проявления болезни на организменном уровне. Но и на молекулярно-биологическом уровне эти научные понятия не менее актуальны и правомерны! Декомпенсация функционального состояния клеток, как правило, обусловлена на молекулярном уровне «нестабильностью генома», причиной которой является появление дополнительных соматических мутаций (ДСМ) и новых ДНК повреждений в хромосомах, сформировавшихся в следствие экстремальных патологических эндогенных или экзогенных воздействий окружающей среды, стрессов и неблагоприятных условий социального микроокружения. Несомненно, что «нестабильность генома» в различных соматических клетках разных органов и тканей в исходе болезни может привести к возникновению необратимой локальной дегенерации и атрофии, прогрессирующему аутоиммунному воспалению или наоборот к запуску канцерогенного процесса. Иллюстрацией этого феномена являются все существующие в мире теории возникновения рака, которые связывают его появление с возникшей «неустойчивостью генома»: неустойчивость хромосом опухолевой клетки (Teodor Boveri ,1914), анеуплоидии (дополнительные хромосомы или отсутствие хромосом), которые ведут к неустойчивости кариотипа (P. Duesburg et al, 2011 ), накопление мутаций в генах приводят нестабильности генов ( F.Urh et al., 2005), появление случайных мутаций в раковых стволовых клетках приводит к генерации дефектных белков (L. A. Loeb,1976), хромосомная нестабильность приводит к появлению мутаций в онкогенах и генах-онкосупрессорах в раковых стволовых клетках (Reya T, Morrison S.J. ,Clark M.F., Weissman I. L.,2001), эмбриональные СК крайне нестабильны и способны трансформироваться в раковые клетки ( Snyder et al.,2001), обратимость трансформации опухолевых клеток при дифференцировке в нормальные клетки из-за нестабильности дефектных белков ( Васильев Ю.М,1986). Но при нормальной работе собственной иммунной системы и ее надлежащему надзору над периферическими региональными клетками тканей и органов прогрессии нейродегенеративного, аутоиммунного и онкологического заболевания не будет даже при наличии нестабильности генома клеток на периферии. Витальные осложнения, обусловленные дополнительными структурными повреждениями хромосом и разрывами и повреждениями ДНК при приобретенных мутациях уже генетически детерминированных и наследственно-дискредитированных дефектных клеток, возникают в первую очередь при вовлечении в патологический процесс системообразующих и системоорганизующих тканеспецифических мультипотентных стволовых и прогенеторных клеток. Именно формирование «неустойчивости генома» в собственных ГСК и гемопоэтических клетках-прогенеторах (ГКП) приводит к патоспецифической иммунной недостаточности, в результате которой аутологичные иммунокомпетентные клетки (ИКК) или становятся аутоагрессивны к высокодифференцированным тканеспецифическим клеткам (нейронам, олигодендроцитам, астроцитам и т.д.) головного или спинного мозга или периферических нервов и вызывают дегенерацию и атрофию их или становятся иммунотолерантны к опухолевым и мутантным клеткам в тканях и вызывают канцерогенез (опухолеобразование). Этот феномен у каждого больного с НБНС можно доказать путем протеомного картирования мембранных антигенов ГСК и ГПК пациента с последующим автоматизированным их профилированием и анализом с использованием технологий искусственного интеллекта (Способ ранней молекулярно-биологической диагностики злокачественных новообразований и бокового амиотрофического склероза / Патент РФ на изобретение RU № 2706714 от 20.11.2019 Бюл. No 32 .- С1.- С 1-26 ( Брюховецкий А.С., Гривцова Л.Ю.). Следствием приобретенного геномно-транскриптомно-протеомного нестабильного состояния ГСК и ГПК, как главных регуляторных клеток организма человека, в большинстве случаев, является лавинообразное нарастание дегенеративно-атрофических процессов в различных участках центральной нервной системы (ЦНС) («минус» нервная ткань), приводящая к глубокой деменции при атрофии коры мозга, тяжелой атаксии при атрофия коры мозжечка, акинетико-ригидных расстройств и дискинезий при дегенерации стриопалидарной зоны мозга или атрофии мышц при повреждении моторных нейронов. В ряде случаев, декомпенсация обусловленная нестабильностью генома в ГСК и ГПК приводит к летальному исходу из-за возникновения онкологических осложнений различных органов и тканей («плюс» патологическая ткань).
Решение проблемы было найдено нами во время фундаментальных молекулярных исследований приобретенных хромосомных структурных изменений и мутаций в поврежденных ГСК и МССК, полученных при смертельной 3-х и 5-ти кратной дозе ионизирующего облучения (Богачев С.С. с соавт., 2008). Обработка супероблученных ГСК и ГПК двухцепочечными ДНК (дцДНК) человека позволила реставрировать повреждения ГСК и нивелировать «нестабильность генома», что привело к эффекту выживания всех экспериментальных животным и восстановить им кроветворение обеспечивающее их выживание. В дальнейшем данный универсальный феномен восстановления смертельно облученного генома в эксперименте сработал на реставрации целого ряда возрастных и патологических мутаций, увеличил продолжительность жизни старых крыс и мышей на 20-22 %, изменив качество их жизни и внешний вид.В результате была разработана природоподобная инновационная биотехнология гомологичной рекомбинации ( равнозначной замены ) мутантных участков ДНК на подобные участки здоровой донорской ДНК (Богачев С.С. с соавт.,2008).В феврале 2021 года эта работа была удостоена Премии Президента России В.В. Путина.В естественных условиях отрицательно заряженные ГСК и ГПК в период митоза (деления) в свою цитоплазму интернализируют (втягивают) из плазмы крови положительно заряженные двухцепочечные ДНК (дцДНК), которые замещают патологические участки ДНК зон мутаций и хромосомных повреждений. Другие дифференцированные клетки крови и тканей не способны или очень ограниченно способны интернализировать фрагменты ДНК из плазмы крови в свою цитоплазму и ядро. Таким образом, был установлен фундаментальный научный факт, что в природе существует внутриклеточный молекулярный механизм клеточной реставрации и молекулярного саногенеза (самовосстановления) поврежденных или пострадавших стволовых клеток и клеток -предшественников и его можно при определенных заданных условиях «рекомбинантной ситуации» отрегулировать для работы в лечебных целях у большинства больных с НБНС.
Данный протокол базируется на том, что при ряде наследственных и нейродегенеративных заболеваниях имеется иммуноопосредованное воспаление в очагах дегенерации, которое способствует прогрессированию клинических симптомов. Предлагаемый протокол включает в себя мобилизацию и сбор СД34+ фракции мононуклеарных клеток (МНК), создание генотерапевтического препарата для ex vivo применения путем использования двухцепочечных ДНК здорового донора, проведение иммуносупрессивной и противовоспалительной терапии, программные внутривенные реинфузии генотерапевтического аутологичного клеточного препарата и интратекальные введения донорских СД34+ МНК в сочетании с моторной реабилитацией. Проведение иммуносупрессивной терапии на первом этапе направлено на подавление иммуноопосредованных механизмов воспаления и аутоиммунизации организма, играющих роль в прогрессировании нейродегенеративных процессов в нервной ткани. В дальнейшем контроль за иммунными механизмами воспаления осуществляется путем применения аутологичных МНК с ГСК и ГПК с молекулярно-реставрированными характеристиками. Интратекальное введение донорских СД34+ МНК направлено с одной стороны на уменьшение воспалительных реакций путем эпигенетической и клеточной регуляции механизмов клеточных и гуморальных воспаления, с другой стороны оказывает протективное действие на нейроны и стимулируя эндогенный нейрогенез в очагах повреждения.
Принцип терапии. Путем лейкоцитофереза на аппарате Spectra Optia (USA) после мобилизации ГСК в периферическую кровь гранулоцитарными колониестимулирующими факторами собираются собственные мононуклеарные клетки и ГСК пациента с НБНС. Они очищаются от тромбоцитов и эритроцитов и в программном замораживателе криоконсервируются в парах жидкого азота в криопробирках. Большая часть пробирок отправляется на хранение в КриоБанк, а 3 пробирки отправляются на генетический и протеомный анализ ГСК. В результате генетического анализа устанавливаются возможности реставрации клональных ГСК конкретного пациента, определяются персонализированные условия создания в биоматериале ex vivo (вне организма) природоподобного молекулярного механизма рекомбинантной ситуации (равнозначного замещения) мутантных генов, определяющих «нестабильность» генома на донорские ДНК человека путем «геномной балансировки» методом добавления двухцепочечных (дц) ДНК человека. При протеомном анализе ГСК картируют и профилируют белковые маркеры мембранной поверхности ГСК пациента и выявляют тип иммунной недостаточности. В экспеименте инкубируют ГСК пациента с дцДНК здорового донора (разрешенная к клиническому применению в России лекарственная субстанция «ПАНАГЕН») и оценивают эффективность реставрации клональных ГСК. Целью этих работ является определение специальных базовых условий (СБУ) для реставрации всего биоматериала для ex vivo реставрации клональных ГСК и их функциональное восстановление. Подобранные персональные СБУ предоставляются на клиническую базу где реализуются их реставрация и клиническая внутривенная реинфузия реставрированных ГСК после иммуносупрессии собственных иммуннокомпетентных клеток доминирующего клона ГСК. Контроль качества геномно протеомной реставрации осуществляется проведение ПЦР генов клональности и протемными исследования мембранных белков ГСК путем проточной цитофлюориметрией.
Результат.Технология не позволяет вылечить все генетические болезни человека, особенно такие сложные как НБНС, да и не ставит себе это в задачу, но она дает реальный шанс остановить прогрессирование и рецидив наследственной нервной болезни за счет природоподобного молекулярного механизма гомологичной рекомбинации мутантных и поврежденных кусков ДНК ГСК и МНК на дцДНК здорового донора и в ряде случаев стабилизировать молекулярно-биологическую структуру его неустойчивого генома, блокировать функционирование раковых стволовых клеток опухоли у больного с НБНС, а также компенсировать неврологическое и соматическое состояние пациента с НБНС. Технология позволяет профилактировать возможность возникновения декомпенсации различных форм НБНС у здоровых компенсированных членов семьи с наследственной семейной отягощенностью и высоким риском развития болезни путем сбора собственных МНК и ГСК в состоянии компенсации и этим обеспечить биостраховку от возможного прогрессирования наследственной болезни путем реинфузии их при возникновении декомпенсации болезни.
Заключение. Решение проблемы было найдено нами и нашими партнерами из Новосибирского НИИ цитологии и генетики СО РАН в лаборатории индуцированных клеточных процессов под руководством проф. д.б.н. С.С. Богачева во время фундаментальных молекулярно-генетических исследований приобретенных хромосомных структурных изменений и мутаций в поврежденных ГСК и МССК, полученных при смертельной 3-х и 5-ти кратной дозе ионизирующего облучения (Богачев С.С. с соавт., 2008). Обработка супероблученных ГСК и ГПК двухцепочечными ДНК (дцДНК) и дцРНК человека позволила реставрировать повреждения молекулярной структуры ГСК и нивелировать «нестабильность генома» в периферических клетках, что привело к эффекту выживания всех экспериментальных животным и позволило восстановить им кроветворение обеспечивающее их выживание. В дальнейшем данный универсальный феномен восстановления смертельно облученного генома в эксперименте в г.Обнинске Калужской области сработал на реставрации целого ряда наследственных, возрастных и патологических мутаций в геноме старых крыс и мышей , увеличил продолжительность жизни старых крыс (30%) и мышей на 20-22 %, улучшив качество их жизни и внешний вид ( Гривцова Л.Ю. с соавт.,2022; Брюховецкий А.С., Гривцова, 2021).В результате совместных усилий московских, обнинских и новосибирских ученых была разработана природоподобная инновационная биотехнология гомологичной рекомбинации ( равнозначной замены ) мутантных участков ДНК в гемопоэтических стволовых клетках на подобные участки здоровой донорской ДНК (Богачев С.С. с соавт.,2008).Завершены доклинические испытания этой технологии по реставрации поврежденного мозга.В феврале 2021 года работа генетиков Новосибиркого НИИ цитологии и генетики СО РАН по реставрации ГСК была удостоена Премии Президента России В.В. Путина.
Таким образом, было показано, что на первом этапе декомпенсации болезни лечить надо не пострадавшие нейроны или другие клетки нервной ткани при НБНС или НДБ, а реставрировать именно собственные кроветворные стволовые клетки, являющиеся родоначальниками патологического клонального кроветворения, приводящего к неустойчивости генома клеток нервной ткани. Природа и эволюция заложили в ГСК потенциал для саногенеза (самореставрации) и его можно и нужно использовать. В условиях эксперимента было доказано, что в естественных условиях отрицательно заряженные ГСК и ГПК в период митоза (деления) в свою цитоплазму интернализируют (втягивают) из плазмы крови положительно заряженные двухцепочечные ДНК (дцДНК) и дцРНК, которые замещают патологические участки ДНК зон мутаций и хромосомных повреждений. Другие дифференцированные клетки крови и тканей не способны или очень ограниченно способны интернализировать фрагменты ДНК и РНК из плазмы крови в свою цитоплазму и ядро. Таким образом,был установлен фундаментальный научный факт, что в природе существует внутриклеточный молекулярный механизм клеточной реставрации и молекулярного саногенеза (самовосстановления) поврежденных или пострадавших стволовых клеток и клеток -предшественников и его можно при определенных заданных условиях «рекомбинантной ситуации» отрегулировать для работы в лечебных целях у большинства больных с НБНС и НДБ.
Таким образом, новый научный взгляд на прогрессирование НБНС и НДБ и механизмы формирования этих осложнений, персонализированный подход в медицине, известные технологии сбора ГСК и их обработки , технологии геномного и протеомного картирования и профилирования клонов ГСК до и после реконструкции с использованием разрешенных лекарственных средств, позволяют принципиально по новому решить проблему борьбы с этими заболеваниями. Все ньюансы этой терапии пациенты смогут обсудить с лечащим врачом.