"Иммунология гемопоэза" HI 2/2006 стр.56

IMMUNOPHENOTYPICPECULIARITIES OF

MOBILIZED STEM (CD34+) CELLS IN BLOOD

FROM PATIENTS WITHSEVERE SPINAL CORD INJURY

Abstract

Imrnimoptienotype of mobilized stem blood celts (CD34+) was studied in 29 patients with late post-traumatic spinal lesions. The CD34+ cells demonstrated different levels of expression of CD45, CD38, monomorphic determinants HLA-DR and gp130 epitopes. Most patients presented with a CD34+ cell fraction with no or low expression of common leukocytic antigen CD45. Only 2 patients had >15% of HLA-DR-CD38- cells in the CD34- fraction. A common transducer molecule of interleukin-6 family cytokines gp130 was expressed on stern (CD34+) cells in all the cases, 26% of the patients had an activated gp130 phenotype. i.e. a combination ofC7+ and Al- epitopes.

Key words: spinal cord injury, CD34, CD45, gp130 epitopes.

Работа выполнена в рамках отраслевой программы РАМН «Новые клеточные технологии - медицине». В период с 2003 по 2005 гг. интратекальное введение мобили­зованных аутологичных стволовых клеток (MACK) проведено 78 пациентам с трав­матической болезнью спинного мозга, в 61% случаев отмечен положительный кли­нический эффект в виде появления или улучшения двигательной активности в паретичных конечностях, улучшения функции тазовых органов, а также частичного.

Трансплантация MACK — это новое направление в неврологии, к механизм восстановления (улучшения) иннервации интратекально вводимыми стволовыми клетками не известен. Трансплантация аутологичных стволовых мобилизованных 1емопоэтических клеток наиболее часто применяется в онкологии и онкогематологии. Суть метода заключается во введении пациенту для восстановления унич­тоженного химиотерапией гемопоэза обогащенной CD34+ клетками фракции мононуклеаров крови, выделенной лейкаферезом. Подобный «заместительный» механизм действия, то есть генерация нейронов из CD34+ стволовых клеток при их интратекальном введении больным спинальной травмой, представляется маловероятным, хотя и не исключен полностью.

Необходимым условием применяемой нами лечебной процедуры являлась моби­лизация стволовых (CD34+) клеток в периферическое кровяное русло (этот факт был подтвержден у всех больных) под действием колониестимулирующих факторов. По этой причине, не исключая, в принципе, роли CD34- фракции интратекально трансплантируемых клеток, мы в рамках данной работы, в первую очередь, сосредо­точились на детальном изучении CD34-позитивных стволовых клетках, т.е. MACK.

Определенный ключ к разгадке проблемы может дать углубленная характеристика качественного состава СD34+ MACK с позиции возможной негемопоэтической коммитированности этих клеток. Для ответа на этот вопрос нами проведено исследование экспрессии на CD34+ MACK молекул CD45 и коэкспрессии HLA-DR и CD38. Другим аспектом работы явилось изучение на CD34+клетках  экспрессии и активации рецептора gp130 — трансдуцерной молекулы цитокинов семейства интерлейкина-6 (ИЛ-6). В гемопоэтических и негемопоэтических стволовых клетках gp1ЗО является корецептором. необходимым для осуществления пролиферативного и дифферениироночного действия следующих цитокинов: ИЛ-6, ЦНТФ (цилиарный нейротрофный фактор), Л ИФ (лейкоз-ингибирующий фактор), ОМ (онкостатин М), КТ-1 (кардиотрофин-1) и ИЛ-11 [1; 2: 5]. Активация gp130 под действием того или иного цитокина может быть оценена на основании эпитопной структуры gp130 [6].

Методика исследования

В исследование включены 29 пациентов позднего периода травматической бо­лезни спиннога мозга (от 3 до 10 лет после травмы). Возраст больных — 17-65 лет

Мобилизация и сбор аутологичных стволовых клеток крови осуществлялись по стандартной методике, рекомендованной и утвержденной Европейским обще­ством трансплантации костного мозга. В качестве колонисстимулирующего фак­тора применен нейпоген.

Стволовые клетки и их субпопуляции в лейкоконцентрате определяли методом прямой иммунофлуоресценции с последующей проточной цитометрией. Исполь­зовали моноклональные антитела (МКА) к CD34 НРСА-2, меченные фикоэритри-ном /РЕ/ (Beckion Dickinson, США), контролем служил мышиный IgGl-PE. В исследованиях субпопуляций стволовых клеток использовали конъюгаты МКА к СО34 с РЕ/Су5 FITC.

Экспрессия молекулы CD45 изучена на мобилизованных стволовых CD34+ клетках у всех 29 пациентов. Использовали МКА к CD45, напрямую меченные FITC (DakoCytomation, Дания). Определение экспрессии молекул HLA-DR (мо­лили с использованием напрямую меченых антител - HLA-DR-PE и CD3S-FITC (Becton Dickinson, США).

МКА к трансдуцерному рецептору gp130 предоставлены J. Вгосhier (INSERM, Франция). Использовали антитела к 2 эпитопам молекулы: А1 в сайте димеризации и С7 в другом функционально активном домене. Конъюгаты этих антител с РЕ/Су5 (для А1) ификоэритрином (для С7) были получены совместное R.Jones (HMDS. Leeds UK)

Анализ данных проводили на проточном цитометре FACScan (Becton Dikinson, США). Субпопуляции стволовых клеток изучали в гейте CD34+ клеток с низкими (близкими к таковым для лимфоидных клеток) характеристиками светорассеяния лазерного луча (Low SSC).

Результаты исследования

Антиген CD45 экс премирован на клетках крови за исключением эритроцитов -незрелых предшественниках, лимфоцитах, гранулоцитах, моноцитах. По мере со­зревания клеток крови экспрессия CD45 на них возрастает. Стволовые гемопозтические клетки характеризуются различными уровнями экспрессии CD45 — от не­значительной до выраженной. Наличие CD45 на стволовых гемопоэтических клетках крови и костного мозга положено в основу одного из наиболее известных про­токолов определения этих клеток - ISHAGE [3]- У 21 из 29 больных с травматиче­ской болезнью спинного мозга среди CD34+ клеток выявлялась отчетливая популя­ция клеток с крайне слабой экспрессиой (ниже уровня на гранулоцитах) или отсут­ствием CD45. У 5 больных (17%) процент CD45- клеток среди CD34+ клеток был небольшим (5-18,9%). у 10 (34%) - умеренным (24-49%) и у 6 (21%) - высоким (62-98%). В 8 случаях (27%) СО45-негативная фракция CD34+ клеток отсутствовала. На рис. 1 приведен пример слабой экспрессии и полного отсутствия CD45 на 98% CD34- клеток, отчетливо видна CD45 фракция.

Экспрессия CD34 характерна не только для гемопоэтических, но и для стромальных предшественников, которые составляют небольшой процент в пределах фракции CD34+CD38-HLA-DR- [7]. Для Более детального изучения этого вопроса нами проведен анализ экспрессии CD38 и HLA-DR на мобилизованных CD34+ клетках крови 12 больных с травматической болезнью спинного мозга. Пропорция CD38-HLA DR- клеток среди CD34+ клеток в большинстве случаев была незначи­тельной (менее 9% у 10 больных) и лишь у 2 больных составила 16% и 23% (рис. 2). В обоих случаях с выраженной пропорцией HLA-DR-CD38- стволовых (CD34+) клеток большинство CD34+ клеток не имело на мембране CD45. В приведенном примере СD45-негативная фракция составила 98%.

Особое внимание нами было уделено оценке экспрессии и активации на моби­лизованных стволовых клетках трансдуцерного рецептора цитокинов семейства интерлейкина-6 — молекуле gp130. Ранее подобных исследований в России и за рубежом не проводилось. У 15 больных с травматической болезнью спинного моз­га изучены 2 эпитопа молекулы — функциональный эпитоп С7, участвующий в пе­редаче сигнала лейкоз-ингибирующего фактора (ЛИФ) и онкостатина М (ОМ), а также функциональный эпитоп A1, вовлеченный в димеризацию gp130 поддействием любого цитокина семейства ИЛ-6 [1]. Различные уровни экспрессии gp130 на CD34+ клетках имели место у всех пациентов: в 13 случаях эпитоп С7 присутствовал на всех CD34+ клетках, в 9 из них отмечена коэкспрессия эпитопа А1, что соответствует не активированному состоянию gp130 [6]. У 4 больных мобили­зованные стволовые клетки мономорфно экспремировал и эпитоп С7, а эпитоп А1 отсутствовал или присутствовал лишь на части клеток. Подобная эпитопная  структура характерна для активации молекулы gp130 под действием ИЛ-6, ИЛ-11, кардиотрофина 1 и цилиарного исйротрофного фактора |6]. У 2 больных наблюдалась экспрессии эпитопа А1 при практически полном отсутствии эпитапа С7. В гематологических системах (клетки гемобластеноп, стволовые гемопоэтические клетки) такое сочетание эпигонов мембранного gpI30 не описано, и теоретически это может соответствовать начальным этапам сигналинта ЛИФ и ОМ, еще не при­ведшим к гетсродимеризации gp130. Различные варианты экспрессии gp130 представлены на рис.3.

Полученные нами данные свидетельствуют о гетерогенности мобилизованных стволовых (CD34+) клеток крови больных с травматической болезнью спинного мозга по экспрессии общелейкоцитарного антигена CD45. У большинства пациентов в популяции MACK присутствовала отчетливая фракция СD45-негативных клеток (CD34+CD45-). Согласно данным литературы, именно эти клетки, так же как и CD38-HLA-DR- клетки потенциально могут дифференцироваться в негемопоэтическом направлении [7]. На сегодняшний день нет методов прямого под­тверждения нейрональной или глиальной коммитированности мобилизованных стволовых клеток. Не исключена возможность приобретения СD45-негативными MACK негемопоэтической направленности дифференцировки в условиях специ­фического микроокружения при интратекальном введении; для CD45+CD34- кле­ток подобный ход развития событий, согласно современным представлениям, полностью исключен.

Наиболее перспективным, на наш взгляд, в проверке гипотезы «заместитель­ной» роли MACK представляется исследование возможности индукции нейрона­льной или глиальной дифференцировки стволовых клеток прямым бес ниток и но­вым воздействием на gp130. Ранее нами подобный механизм был установлен для гемопоэтических стволовых клеток [2; 4], однако на нейрональных предшествен­никах не изучался. Представленные в работе данные свидетельствуют об экспрес­сии gpl30 на MACK (CD34+) как в неактивированном состоянии (эпитопы А1+С7+), так и в активированном (А1-С7+). Более того, в 2 случаях отмечено прак­тически полное отсутствие эпигона С7, что, теоретически, может иметь место на начальных этапах сигналинга ОМ и ЛИФ.

Нами не ставилось задачи оценить эффективность лечения последствий травмы с помощью МАСК в зависимости от наличия в их популяции CD45 - негативных клеток и от активационного статуса gp130. Положительные клинические эффекты от­мечены и у больных с отсутствием СD45-негативных MACK. Это говорит о возмож­ности терапевтического эффекта не только CD34+CD45 MACK, но и вводимых одновременно с ними СD34-негативных или CD34+CD45+ клеток. На сегодняшний день «заместительный» механизм действия MACK (упрощенно говоря, генерация из них нейронов) представляется наиболее уязвимым и трудно доказуемым. Представляется очевидным, что важную роль в восстановлении или улучшении иннервации тканей под действием MACK могут играть процессы индукции роста нервных отростков, их миелинизации, ангиогенеза. а также целый ряд других факторов.

Список литературы

1.Тупицын Н.Н. Гематология и трансфузиология. 2001. Т.46, №4. С.9-14.

2.Тупицын Н.Н., Андреева Л.Ю., Вулъфова Ю.И. и др. Гематология и трансфузиология. 2002.Т.47. №2. С.3-13 .

3.Allan D.S., KeeneyM., Howson-Jan К. Bone Marrow Transplant. 2002. Vol.29. Р.%7-72.

4.Aulissier P., De VosJ., LiautardJ., Tupitsyn N. et al. International Immunology. 1998. V.10, N12. P.1881-9.

5.Rose-John S. Trends in Biotechnology. 2002. \bl.20, N10. P. 417-9.

6.Tupitsyn N.N., Kadagidze Z.G., Gaillard J.-P. el al. Clin. Lab. Haematol. 1998. V.20. P. 345-52.

7.Walter E.K., OlwensJ., Lund-Johansen F. etal. Blood. 1995. Vbl.85. N9. P. 2422-35.

	Рис. 1. Мобилизованные стволовые (CD34+) клетки крови, не имеющие на мембра­не шгтигена CD45: А — характеристик и рассеяния света лазерного луча клетками цитаферезного продукта. По оси X — прямое светорассеяние (FSC) в обычных единицах (канал детектора); по оси Y (на рисунках 1А, 1В, 1C, ID) - боковое светорассеяние (SSC); В - стволовые клетки (CD34+) в гейте R1 составляют 0.4% от общей клеточной популя­ции. По оси X (на рисунках 1В, 1C, ID) — интенсивность флуоресцентного сигнала в обыч­ных единицах (lg канала флуоресценции) по PE/FL2/; С - пороговое значение уровня экспрессии CD45 (РегСР - FL3), определенное на осно- D - лишь 6% клеток гейта R1 (стволовые CD34+ клетки) экспрессируют CD45, осталь­ные - СО45-негагипны. CD45- фракция содержит как абсолютно CD45-негативные клетки, так и клетки слабопозитивные по CD45. На диаграммах А и С представлено 2.000 событий, на диаграмме В — 50,000 и на диаграмме D — 200 событий (0.4% от 50.000, гейт Rl)
	Рис. 2. Экспрессия HLA-DR и CD3S на мобилизованных стволовых (CD34+) клет­ках крови: А, В. С - коэкспрессия молекул. С, D, E, F - фракция HLA-DR CD38- среди CD34+ клеток. А - стволовые (CD34+) клетки составляют 0.44% от общего числа клеток (гейт R1); В- контрольное окрашивание в гейте CD34+ (FL1 vs FL2); С - 95% CD34+ клеток коэкспрессируют CD38 и HLA-DR на мембране. CD45-негативные стволовые клетки (CD34+) составили в этом случае 65%; D - гейт стволовых клеток; Е - контрольное окрашивание; F - 23% CD34+ клеток не экспреесируют HLA-DR and CD38 (HLA-DR CD38 ). 98% стволовых (CD34+) клеток не экспрессируют CD45 в этом случае.
	Рис. 3. Мембранная экспрессия эпитопов gp130 на мобилизованных стволовых клетках крови больных (гейт CD34+ клеток). По оси X - интенсивность флуоресцентного сигнала (канал флуоресценции), по оси Y – количество клеток. Заштрихованный пик – контрольное окрашивание, незаштрихованный пик - окраска на эпитопы С7 (А, С) и А1 (В. D). Л. В - клетки пациента К.: gp130 не активирован (оба эпитопа присутствуют на мембране). С, D – клетки пациента В.: молекула gp130 находится в активированном состоянии (присутствует эпитоп С7. эпигон А1 практически отсутствует).