Стволовые клетки: сомнения и надежды. Роберт Ланца и Надя Розенталь. В Мире Науки, Cентябрь 2004 г.

Роберт Ланца и Надя Розенталь (Robert Lanza, Nadia Rosenthal) - ведущие специалисты в области изучения стволовых клеток. Ланца - директор по медицинским вопросам в компании Advanced Cell Technovogy, Inc. и доцент Института регенеративной медицины Уэйк-Форестского университета. Он занимается изучением ES-клеток человека, клонированием, регенерацией тканей и партеногенезом. Розенталь возглавляет Европейскую лабораторию молекулярной биологии в Риме. Предмет ее исследований - регенерация нервно мышечных соединений и сердечной мышцы с помощью ES-клеток, развитие сердца эмбриона.

Какие препятствия нужно преодолеть, чтобы использование стволовых клеток в медицине перестало быть только мечтой? Стволовые клетки таят в себе невиданные возможности: от регенерации поврежденных органов и тканей до лечения заболеваний, не поддающихся лекарственной терапии. Но реально ли применение этих клеток в медицине? Сумеют ли врачи приступить к лечению больных с их помощью сразу же после отмены соответствующих ограничений? По-видимому, нет. Даже сама идентификация стволовых клеток - это проблема. Прежде чем проводить те или иные эксперименты, необходимо убедиться, что эти клетки действительно являются тем "стволом", из которого, как ветви, вырастают все другие типы клеток, а также, что они способны к самовоспроизведению.

Наиболее универсальны эмбриональные стволовые (ES - embrionic stem) клетки, впервые выделенные из мышиных эмбрионов 20 лет назад. Они были взяты на самой ранней стадии развития плода из той его части, которая в норме дает начало трем разным слоям (зародышевым листкам) более позднего эмбриона (см. рис. на стр. 57) и, в конце концов, - всем органам и тканям. Это свойство ES-клеток предопределило их название - плюрипотентные.

В поисках стволовых клеток

Некоторые линии дифференцируются в клетки только одного типа, другие вообще плохо растут в культуре. Чтобы проверить, являются ли клетки плюрипотентными, американские биологи предложили два теста, давно апробированных на ES-клетках животных. Таким образом, ученые надеются стандартизировать эксперименты, проводимые на ES-клетках человека. Первый тест основан на введении предполагаемых ES-клеток в организм какого-нибудь животного. Если у того образуется тератома (опухоль, содержащая клетки всех трех зародышевых листков), то плюрипотентность можно считать доказанной. Второй тест заключается в маркировке клеток-кандидатов и введении их в развивающийся эмбрион. Если клетки оказываются во всех тканях родившегося детеныша, то они скорее всего плюрипотентны. Однако применение подобной методики может привести к появлению животного-химеры, во всех тканях которого присутствует человеческая ДНК, что с этической точки зрения неприемлемо.

Чтобы надежно идентифицировать истинно плюрипотентные клетки, необходимо выявить гены, способные включаться и выключаться в разное время в культивируемых ES-клетках. Наличие такого профиля экспрессии генов не только стало бы инструментом для подтверждения способности клеток дать начало всем органам и тканям, но и позволило бы понять механизм самого феномена. К сожалению, профиль экспрессии генов ES-клеток пока дает противоречивые результаты.

Конечная цель экспериментов на ES-клетках - разработка новых методов замены или регенерации нефункционирующих клеток и органов, например, островковых клеток поджелудочной железы, вырабатывающих инсулин (их повреждения вызывают диабет), или нейронов, высвобождающих дофамин (их выход из строя лежит в основе болезни Паркинсона). Однако ученые не располагают надежными методами переключения ES-клеток на путь образования нужных тканей.

В культуре ES-клетки дифференцируются в беспорядочную массу клеток разного типа. Однако если воздействовать на них химическими веществами в строго определенные промежутки времени, то они начинают специализироваться в клетки какого-то одного типа, правда, охотнее образуют лоскуты сокращающейся сердечной мышцы, чем какие-либо другие ткани.

Как заставить клетки работать?

Поскольку до сих пор неизвестно, каким инструкциям подчиняются ES-клетки во время развития эмбриона, многие ученые занялись изучением естественной эмбриональной "ниши", с тем чтобы понять, какими внешними сигналами можно было бы воздействовать на процесс. Другие исследователи пытаются отследить характер изменения профиля экспрессии генов по ходу дифференцировки, надеясь выявить те из них, чье включение или выключение направляло бы развитие клеток по тому или иному пути.

ES-клетки можно без особого труда заставить образовывать нейроны в чашке Петри, однако результат от этого будет, только если их удастся "вживить" в фунционирующий мозг и наладить связь с соседними нейронами. Казалось, в 2001 г. произошел прорыв в этой области - Роналд Маккей (Ronald McKay) из национальных институтов здравоохранения сообщил, что наконец-то регенерировал инсулин продуцирующие клетки из мышиных ES-клеток. Однако не прошло и двух лет, как Дуглас Мелтон (Douglas A.Melton) из Гарвардского университета, пытаясь повторить опыты Маккея, обнаружил, что регенерированные клетки поглощали инсулин из культуральной среды, а не синтезировали его.

Если бы ES-клетки можно было инъецировать в тот орган, который необходимо регенерировать, организм смог бы сам контролировать процесс с помощью сигналов, посылаемых окружающими тканями. Однако плюрипотентность ES-клеток таит в себе слишком много неожиданностей, чтобы такой подход можно было использовать в медицинских целях. Введенные клетки могут инициировать образование тератомы или тканей совсем другого типа, чем нужно. Однажды в экспериментах на животных ученые получили тератомы, содержавшие полностью сформировавшиеся зубы.

Чтобы не думать о том, что в результате инъекции ES-клеток в организм человека у него в мозгу или в сердце появится опухоль, вооруженная зубами, многие исследователи решили пойти обходным путем. Дождавшись перехода ES-клеток в более стабильное, но все еще весьма пластичное состояние родоначальных клеток, можно предотвратить неконтролируемую дифференциацию и сохранить способность реагировать на сигналы, посылаемые окружением, а также давать начало клеткам нужного типа.

Но и здесь существуют проблемы. Клетки-предшественники могут вызвать иммунную реакцию со стороны организма-хозяина: подобно клеткам трансплантированных органов, они несут на своей поверхности антигены, воспринимаемые иммунной системой как сигнал к атаке. Поскольку возможны сотни комбинаций различных антигенов, понадобятся сотни, а возможно, и тысячи линий ES-клеток для создания банка клеток, из которого можно было бы выбрать те, которые совместимы с организмом больного. Для этого потребуются миллионы эмбрионов, отбракованных в клиниках по искусственному оплодотворению. Поэтому не все ученые поддерживают идею создания подобного банка. По их мнению, можно подавить иммунный ответ больного на ES-клетки и их производные или изменить антигенные свойства самих клеток. Реалистичность такого подхода еще предстоит подтвердить, а пока единственный способ устранения иммунологического барьера - создание линии ES-клеток с использованием собственного генетического материала пациента путем переноса клеточного ядра, или клонирования. Этот метод имеет свои недостатки и вызывает серьезные возражения, но он уже апробирован на животных и дал обнадеживающие результаты в экспериментах по регенерации тканей.

Можно ли перевести часы назад?

Клонирование можно рассматривать как один из способов омоложения организма на клеточном уровне. Тело человека состоит более чем из 200 различных типов клеток. Но если клетка приобрела какую-то специализацию, то в норме обратного пути нет - она дифференцируется окончательно и бесповоротно. Однако если заменить ядро неоплодотворенной яйцеклетки ядром клетки соматической (неполовой), она может повести себя как оплодотворенная, т.е. приступит к делению. ES-клетки образующегося эмбриона будут содержать ДНК донорной соматической клетки, а она сама будет перепрограммирована и перейдет в ранг стволовой с присущей ей способностью регенерировать ткани разного типа.

Недавно мы провели следующий эксперимент: частично дифференцированные стволовые клетки, полученные от клонированного мышиного эмбриона, инъецировали в сердце грызуна, перенесшего инфаркт. Обнаружилось, что в течение месяца произошла замена 38% клеток зарубцевавшейся ткани сердечной мышцы нормальными клетками (см. фото слева). А в этом году методом переноса ядра соматической клетки (Somatic cell nuclear transfer, SCNT) впервые была получена линия ES-клеток человека. Может быть, с помощью этого подхода удастся преодолеть преграды на пути использования стволовых клеток в терапевтических целях? Первый важный шаг на этом пути уже сделан. В феврале Ву Сук Хванг (Woo Suk Hwang) из Сеульского национального университета сообщил, что, используя SCNT-метод, он создал эмбрион человека, вырастил его до стадии бластоцисты и получил плюрипотентные клетки.

В распоряжении Хванга было 242 яйцеклетки, что позволило варьировать условия проведения эксперимента и поэтапно проследить весь процесс. Но даже в этих условиях удалось получить лишь одну линию ES-клеток. Механизм перепрограммирования яйцеклетки при таком способе ее оплодотворения во многом остается загадкой - точно так же, как и процесс развития из нее эмбриона.

Нет уверенности и в том, что по ходу перепрограммирования или в процессе манипуляций с эмбрионом в его генетическом материале не произойдут мутации и образующиеся ES-клетки не превратятся в раковые. Далее, прежде чем переносить ядро соматической клетки больного, необходимо устранить в его ДНК мутации, которые могут быть причиной наследственных заболеваний (например, гемофилии или мышечной дистрофии). К счастью, методы геноспецифичной модификации, повсеместно осуществляемой в экспериментах на ES-клетках мышей, были апробированы и на ES-клетках человека, так что предварительное устранение мутаций в донорской ДНК перед введением ее в яйцеклетку не должно оказаться проблемой.

Большим вопросом остается и полноценность ES-клеток, происходящих от клонированных эмбрионов. Известно, что попытки получить жизнеспособных клонированных животных часто заканчивались неудачей: четвероногие либо погибали, либо имели многочисленные отклонения от нормы. Однако проверка потенциала клонированных ES-клеток путем введения их в развивающуюся бластоцисту дала положительный результат: появившееся на свет животное было совершенно нормальным. Отсюда следует, что если о репродуктивном клонировании применительно к человеку пока нечего и думать, то над использованием ES-клеток в терапевтических целях, полученных методом переноса ядра, необходимо работать.

Аналогичные опасения вызывает и другой метод получения ES-клеток - партеногенез (в переводе с греческого - "непорочное зачатие"), когда яйцеклетку стимулируют к делению с помощью химических веществ. Псевдоэмбрион (партенот) выращивать гораздо проще, чем полученный методом переноса ядра. В опытах на животных из партенот были получены ES-клетки, способные к нормальной дифференцировке в культуре и прошедшие тест на образование тератомы.

Костный мозг - это "обиталище" кроветворных (гемопоэтических) клеток, наиболее полно изученных стволовых клеток взрослого организма. Они дают начало родоначальникам всех клеток крови и иммунной системы. Помимо этого в костном мозге содержатся клетки, к которым можно отнести многие нерешенные вопросы, касающиеся идентификации и потенциала взрослых стволовых клеток. Речь идет о стромальных стволовых клетках, из которых образуются предшественники жировой и костной ткани и которые, возможно, являются родоначальниками других недавно открытых клеток - мезенхимальных стволовых и так называемых МАРС (Polypotent stem progenitor cells). Взрослые стволовые клетки присутствуют и во многих других тканях - головном мозге, тканях глаза, коже, мышцах, стенках кровеносных сосудов, желудочно-кишечном тракте, но неизвестно, происходят ли они из самих этих тканей или являются потомками циркулирующих в крови гемопоэтических клеток

В отличие от обычных клеток, в которых присутствуют хромосомы от обоих родителей, партеноты содержат удвоенный набор хромосом исходной яйцеклетки. Они обладают полным комплектом генов, но не подлежат имплантации в матку суррогатной матери. Имея только одного родителя, партенот несет половину возможных антигенов, а потому при введении в хозяйский организм встречает меньшее противодействие со стороны иммунной системы. Чтобы охватить иммунологические характеристики большей части населения США, нужно создать банк по крайней мере из 1000 партеногенетических ES-клеточных линий.

Скрытый потенциал

Заживление ран на коже начинается сразу же после их появления. Печень человека в течение одной недели может регенерировать до 50% своей клеточной массы, а в крови каждую минуту появляется 350 млн. новых эритроцитов. Известно, что во всех быстро восстанавливающихся тканях имеются активно пролиферирующие стволовые клетки. Почему к столь же быстрой регенерации не способны другие органы, в первую очередь мозг и сердце, в которых недавно тоже были обнаружены клетки, претендующие на статус стволовых?

Наиболее полно были изучены кроветворные (гемопоэтические) стволовые клетки взрослого организма. Они находятся в костном мозге и дают начало всем форменным элементам крови и лимфы. Стволовые клетки, дифференцирующиеся в семейство клеток одного органа или ткани, называют полипотентными. Есть надежда, что они будут обнаружены и в других органах, и тогда для регенерации не придется проводить манипуляции на эмбрионах. А может быть, будут открыты "взрослые" стволовые клетки, приближающиеся по степени плюрипотентности к эмбриональным.

Пока же ученые пытаются выяснить, не блокирован ли каким-либо образом процесс саморегенерации в тканях, где он идет очень медленно, и нельзя ли его разблокировать. Сам источник различных взрослых стволовых клеток, а также их потенциал пока до конца не установлены. Не ясно также, происходят ли тканеспецифичные стволовые клетки во взрослом организме от самой этой ткани или от циркулирующих в крови гемопоэтических стволовых клеток. Остается неизвестным и то, как далеко могут продвинуться эти клетки на пути к неприсущей им специализации и удастся ли осуществить такую "трансдифференциацию" не только в лаборатории, но и in vivo.

К мысли о том, что некоторые взрослые стволовые клетки обладают большим потенциалом, ученых подтолкнули наблюдения за больными, которым был пересажен костный мозг: обнаружилось, что донорные клетки распространились по многим тканям реципиента. Следовательно, при определенных условиях стволовые клетки костного мозга могут дифференцироваться в клетки практически любого типа. (Аналогичным свойством обладают фетальные стволовые клетки, выделенные из пуповинной крови новорожденного.)

Однако неоднократные попытки проверить теорию пластичности взрослых стволовых клеток на живых организмах не увенчались успехом. В марте этого года появились два сообщения на эту тему. Леора Болсэм (Leora Balsam) из Стэнфордского университета и Чарлз Марри (Charles E. Murry) из Вашингтонского университета независимо друг от друга попытались обнаружить кроветворные стволовые клетки в сердечной мышце мыши, перенесшей инфаркт. Никаких следов их участия в регенерации негематопоэтической ткани не выявилось.

Однако было обнаружено масштабное слияние стволовых клеток костного мозга с клетками сердечной мышцы, печени и мозга, заставляющее по-иному взглянуть на феномен трансдифференциации. В будущих исследованиях взрослых стволовых клеток необходимо исключить возможность их простого слияния с клетками данного органа. Только в этом случае можно будет говорить об их участии в регенерации "непрофильного" для них органа.

В исследованиях тканеспецифичных стволовых клеток уже достигнуты ощутимые успехи. В Германии проводилось обследование пациентов, перенесших обширный инфаркт миокарда, которым непосредственно в поврежденный участок инъецировали их собственные родоначальные клетки сердечной мышцы. За 4 месяца размер поврежденной области уменьшился на 10% и работа сердца улучшилась.

Основным препятствием к клиническому применению взрослых стволовых клеток служит малочисленность их популяции в тканях и трудности выделения. Так, в костном мозге взрослой мыши их всего 1 на 10000, а для человека эта величина может быть еще меньше. Непредсказуема и локализация стволовых клеток для большинства тканей, а возможности их идентификации с помощью поверхностных маркеров или профилей экспрессии генов весьма ограниченны.

Даже если взрослые стволовые клетки выделены, их еще нужно научиться культивировать, т.к. они растут чрезвычайно медленно. Как и в случае ES-клеток, мало что известно о факторах, определяющих судьбу взрослых стволовых клеток. Мы не знаем также, как повлияет на их способность к регенерации тканей больных процесс культивирования.

Вместо того чтобы тратить силы на выделение, культивирование и введение в организм стволовых клеток больного, может быть, стоит мобилизовать скрытые возможности самого организма? Появляется все больше данных о том, что стволовые клетки, аналогично клеткам метастазирующих опухолей, воспринимают химические сигналы, направляющие их к тем местам в организме, где возникли повреждения. Недавно мы обнаружили, что по сигналу белка IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1) мышиные стволовые клетки отправляются в длительные путешествия в организме животного (см. фото слева).

Чтобы мобилизовать организм на запуск процессов регенерации с помощью стволовых клеток, необходимо досконально понять роль химических сигналов. Возможно, IGF-1 не только способствует адресной доставке стволовых клеток, но и принимает участие в переходе клеток поврежденной ткани в полипотентное состояние с последующей их дифференциацией. Этот феномен, известный под названием эпиморфическая регенерация, лежит в основе удивительной способности тритона и рыбы-зебры к регенерации целых органов.

Заветная мечта ученых - найти способы контроля дедифференциации тканей взрослого организма, по существу научиться превращать полностью дифференцированные клетки в стволовые. Но регенеративная терапия, основанная на дифференциации, - это дело далекого будущего, и скорее всего приблизить его помогут исследования как эмбриональных, так и взрослых стволовых клеток.

Что впереди?

Пока изучение стволовых клеток породило больше вопросов, чем дало ответов. Однако результаты первых тестов на возможность применения взрослых стволовых клеток для лечения сердечно-сосудистых заболеваний весьма обнадеживают. Проведены успешные эксперименты на животных по применению производных ES-клеток для лечения нейродегенеративных расстройств, что, возможно, подтолкнет соответствующие клинические испытания на человеке.

Мы уверены, что за регенеративной терапией на уровне клеток и органов большое будущее. Весьма серьезные препятствия на пути ее развития пока не устранены, но преодолимы.