"Динамика соматосенсорных вызванных потенциалов у пациентов с хроническим повреждением спинного мозга при лечении аутогенными гемопоэтическими стволовыми клетками" Журнал "Клеточная трансплантология и тканевая инженерия" Том III, № 2, 2008.

АС. Брюховецкий 1, А.А. Фролов 2, Н.И. Коваленко 2

1. ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, кафедра клеточной восстановительной терапии

2. ЗАО Клиника восстановительной неврологии и терапии «НейроВита»

The dynamics of somatosensory evoked potentials in patients with spinal cord injury treated by autologous haematopoietic stem cells

AS. Bryukhovetskiy 1, A.A. Frolov 2, N.I. Kovalenko 2

1. Russian State Medical University, Department Cell Restorative Medicine

2. Interventional and restorative neurology & therapy clinic «NeuroVita»

Целью исследования являлась нейрофизиологическая оценка воздействия клеточной восстановительной терапии на функцию афферентных путей спинного мозга при его повреждении. Проведено динамическое исследование соматосенсорных вызванных потенциалов (ССВП) у пациентов с хронической травматической бо-лезнью спинного мозга при повторной трансплантации аутогенных гемопоэтических клеток. По результатам исследования выявлено три стабильных эффекта воздействия гемопоэтических стволовых кле-ток: 1) восстановление ранних корковых компонентов ССВП; 2) уве-личение амплитуды ранних компонентов; 3) уменьшение латентнос-ти ранних компонентов. Признаков ухудшения функции спинальных проводников не отмечалось ни у одного больного. Полученные дан-ные указывают на восстановление нервных волокон, составляющих пути проприоцептивной чувствительности спинного мозга.

Ключевые слова: спинной мозг, гемопоэтические стволовые клетки, соматосенсорные вызванные потенциалы, проприоцептивная чувствительность.

Тhе aim of this study was neurophysiologic estimation of cell restorative therapy influence on afferent pathways of the injured spinal cord. The dynamic somatosensory evoked potentials studies were performed in chronic spinal cord injury patients treated by repeated transplantations of autologous haematopoietic stem cells. The data analysis revealed three stable effects of stem cells: 1] restoration of early cortical components of SEP; 2) Increase of early potentials amplitude; 3) Decrease of early potentials latency. No signs of worsening of spinal pathways function were revealed in any of the patients. The obtained data indicate on the restoration of nerve fibers, constituting the proprioceptive pathways of spinal cord.

Key words: spinal cord, haematopoietic stem cells, somatosensory evoked potentials, proprioception.

Введение

При нейрорегенераторной клеточной терапии спи-нальной травмы динамика восстановления нарушенных функций, как правило, отличается индивидуальными осо-бенностями. У разных пациентов в начале лечения преиму-щественный эффект воздействия стволовых клеток может проявиться в двигательной, чувствительной сферах, восста-новлении контроля над функциями тазовых органов и др. Комплексная оценка динамики выздоровления имеет важное значение для получения максимально полной и своевременной информации о специфике репаративно-регенераторных процессов в спинном мозге, изучения различных аспектов влияния трансплантации стволовых клеток на нервные ткани [1].

В предыдущем исследовании [2] нами были изучены кли-нические и электрофизиологические показатели улучшения моторной функции у больных с травматической болезнью спинного мозга [ТБСМ]. Относительно сложной задачей является мониторинг состояния сенсорных функций. При физикальном обследовании стандартная оценка чувствительности [по ASIA] у больных с ТБСМ является достаточно грубой [3, 4]. Для более точной, количественной оценки необходимо исследование соматосенсорных вызванных по-тенциалов [5, 6].

В ряде работ опубликованы данные исследования со-матосенсорных вызванных потенциалов [ССВП] при оценке эффективности восстановительной клеточной терапии у пациентов с ТБСМ [7-9]. Однако они в основном касаются применения трансплантации стволовых клеток в остром периоде (2-3 месяца после травмы). В это время бурное те-чение спонтанных восстановительных процессов не по-зволяет выделить эффекты, непосредственно связанные с действием стволовых клеток.

Целью настоящей работы является изучение методом ССВП эффекта нейрорегенераторной клеточной терапии у больных с ТБСМ. Для этого проводилось динамическое ис-следование ССВП у пациентов с хронической ТБСМ, основ-ным методом лечения которых являлась интратекальная трансплантация аутогенных гемопоэтических стволовых клеток.

Материал и методы

Анализ динамики ССВП проводился у 21 пациента (17 мужчин и 4 женщины), чей возраст составил от 18 до 60 лет [33,48+13,32). Давность травмы составляла от 1 до 19 лет (4,57±3,74). Уровень травмы были различный - C3-L1. Ни одному из включенных в группу пациентов в период наблю-дения не проводилось оперативных вмешательств.

Для трансплантации применялся только аутогенный кле-точный биоматериал. Периферические гемопоэтические стволовые клетки (ПГСК) были получены у каждого из обсле-дованных пациентов методом афереза после мобилизации с помощью ростовых факторов (гранулоцитарный колоние-стимулирующий фактор, Г-КСФ). С этой целью применялся препарат Граноцид в течение 4-х сут. в стандартных дозах. Схемы мобилизации были однотипными. Сбор ПГСК осуще-ствляли по стандартной методике на день +4 путем сеанса пейкафереза на сепараторе клеток крови Spectra Coba. Кле-точность сепарата составляла 15-20x108 ядросодержащих клеток и от 17 до 25x106CD34+ клеток. Материал был раз-делен на 15-20 аликвот объемом 6-8 мл с содержанием в пробирке 6-8x106 CD34+, лейкоцитов - 1,3-1,5x109. Одну из пробирок направляли на стандартизацию и сертифика-цию клеточного препарата, другие криоконсервировали в стерильных условиях по стандартной методике с 10% раство-ром ДМСО и полиглюкином. При иммунологическом анали-зе клетки цитоконцентрата освобождали от эритроцитов стандартным методом лизиса (раствор FACS Lysing solution-Becton Dickinson, США). Окрашивали прямыми конъюгатами моноклональных антител к антигену CD34 (клон НРСА-2) и на втором этапе докрашивали антителами к дифференци- рованным лейкоцитам человека. Сбор и учет данных прово- дили на проточном цитофлюорйметре FACScan (Becton Dickinson, США) с использованием программы Lysis II. По- лученный биоматериал исследовали методом проточной цитофлюориметрии с использованием двойной и тройной флюоресцентной окраски аферезного продукта. Для трансплантации пациентам использовали биома-териал одной криоконсервированной пробирки с ПГСК.

Перед применением клеточного препарата его размора-живали, отмывали центрифугированием с 0,9% раствором NaCI от ДМСО и полиглюкина и трансплантировали интра- текально в субарахноидальное пространство во время стандартных люмбальных пункций каждые 3 месяца в те-чение полутора лет.

У каждого пациента (до начала клеточной восстанови-тельной терапии) были зарегистрированы первичные ней-рофизиологические данные. Затем исследование проводилось с интервалом в 3-4 месяца в процессе лечения. Период наблюдения составлял от 1 года до полутора лет. Исследо-вание ССВП на стимуляцию большеберцового нерва роводилось у всех пациентов, исследование ССВП на сти-муляцию срединного нерва - только при повреждении на шейном уровне.

Для записи ССВП использовался прибор Keypoint Medtronic, США. ССВП регистрировались с поверхности головы с помощью обычных дисковых электродов диамет-ром 5 мм. При записи потенциалов, вызванных стимуля-цией правого срединного нерва, активный электрод рас-полагался в точке СЗ, левого срединного нерва - в точке С4 (согласно международной системе электроэнцефало-мграфических отведений «Ю-20%» [10]). При записи по-тенциалов, вызванных стимуляцией левого или правого большеберцового нерва, активный электрод располагался в точке Cz. Референтный электрод располагался в точке Fz. эяЭпоха анализа была установлена 200 мс для ССВП верх-них конечностей и 500 мс для ССВП нижних конечностей. Чувствительность составляла 5 мкв/деление. Частотная полоса: 1 Гц - 2000 Гц. Стимуляция осуществлялась стан-дартным стимулятором Keypoint с расстоянием между ано-дом и катодом 20 мм, импульсами прямоугольной формы, длительностью 0,2 мс, интенсивностью 20 мА и частотой 3,3 Гц при стимуляции срединного нерва, интенсивностью 40 мА и частотой 0,47 Гц при стимуляции большеберцо-вого нерва. Стимуляция срединного нерва проводилась в области запястья, а большеберцового нерва - в области лодыжки. При анализе результатов проводилась суперпо-зиция усредненных ответов двух серий стимуляции по 300 стимулов каждая.

В зависимости от первичных данных (ССВП до лечения) пациенты были разделены на 3 группы. I группа: в паттерне ССВП присутствуют коротко-латентные (ранние) компо-ненты [11]. Ранние компоненты идентифицировались как N20-P23 - при стимуляции срединного нерва и P38-N45 при стимуляции большеберцового нерва. II группа: коротко-латентные компоненты не определяются, но присутствуют длинно-латентные (поздние) потенциалы. Ill группа: вызван-ные потенциалы отсутствуют. У ряда пациентов отмечалась значительная асимметрия показателей ССВП при стиму-ляции правой и левой конечностей, что соответствовало асимметричному поражению спинного мозга. Поэтому груп-повой анализ для ССВП, полученных при стимуляции раз-ных конечностей, проводился по отдельности.

Изучались количественные и качественные изменения паттерна ССВП за период наблюдения. Количественный анализ изменений амплитуды и латентности ранних ком-понентов проводился у пациентов I группы. Критериями качественных изменений паттерна ССВП во II и III группах служили появление новых компонентов или исчезновение имевшихся компонентов паттерна ССВП. При этом учиты-вались только те изменения, которые были стабильны при повторных исследованиях.

Результаты

За период наблюдения отмечалось полное восста-новление отсутствовавших ранних компонентов в ССВП верхних конечностей у 2-х пациентов и в ССВП нижних ко-нечностей у 4-х пациентов (рис. 1).

Исчезновения ранних компонентов ССВП не отмечалось ни у одного из пациентов (табл. 1)

В III группе не было ни одного случая появления ран-них компонентов. Появление поздних компонентов (рис. 2) отмечалось лишь у одного больного (T12-L1 уровень). Появившийся поздний потенциал демонстрировал устой-чивую тенденцию к уменьшению латентности в процессе лечения.

Количественный анализ данных был проведен только у пациентов с шейным уровнем повреждения, так как ни в од-ной из записей, сделанных до начала и во время лечения у пациентов с другими уровнями поражения, ранние компо-ненты ССВП не выявлялись. Оценка изменений латентнос-ти ранних компонентов могла быть произведена только у пациентов I группы. Вычисления изменения амплитуды проводились у всех пациентов, при этом отсутствие компо-нентов принималось за нулевое значение (табл. 2).

Через 12-18 месяцев от начала клеточной терапии от-мечались следующие количественные изменения ранних компонентов ССВП.

1. Уменьшение латентности: а) N20 при стимуляции срединного нерва (см. табл. 2); б) Р38 (-1,95±1,39 мкВ, N = 6) при стимуляции большеберцового нерва (рис. 3).

2. Увеличение амплитуды: a) N20-P23 (межпиковой) при стимуляции срединного нерва (см. табл. 2); б) Р38 (0,06±0,69 мкВ, N = 20) при стимуляции большеберцового нерва.

Обсуждение

В результате динамического исследования соматосенсорных вызванных потенциалов были выявлены три основных эффекта восстановительной клеточной терапии у больных с хронической травматической болезнью спинного мозга:

1) восстановление ранних компонентов ССВП;

2) увеличение амплитуды;

3) уменьшение латентноети ранних компонентов.

По классическим представлениям, ранние компоненты ССВП являются потенциалами, генерируемыми в первичной сенсомоторной коре головного мозга вследствие поступления нервных импульсов по путям проприоцептивной чувствительности: периферический нерв - задние столбы спинного мозга - продолговатый мозг - кора больших полушарий головного мозга [10, 11]. Возникновение отсутствовавших ранних компонентов ССВП в процессе лечения трактуется как признак восстановления функции поврежденных путей проприоцептивной чувствительности [6, 7]. Этот эффект наблюдался у пациентов с шейным уровнем повреждения более чем в половине случаев в ССВП как верхних (66%), так и нижних (50%) конечностей. Исчезновения компонентов ССВП в процессе лечения не наблюдалось ни у одного больного. Этот факт важен при изучении побочных эффектов метода клеточной терапии.

Нарастание амплитуды ранних компонентов может указывать на увеличение количества проводящих аксонов спи-нальных путей проприоцептивной чувствительности [5, 9]. Данный эффект превалировал в ССВП, получаемых при стимуляции срединного нерва (амплитуда,увеличивалась в среднем на 40%). Подобный результат кажется нам вполне закономерным в контексте часто наблюдаемого снижения неврологического уровня на один-два сегмента по клиническим данным. Если принять во внимание, что стимулируемый срединный нерв формируется из С5-Т1 корешков, очевидно, что в большинстве случаев (при шейном уровне повреждения) в его составе имеются волокна, вступающие в спинной мозг ниже уровня повреждения. Одновременно со снижением уровня в составе срединного нерва должно увеличиваться количество волокон, по которым нервный импульс способен достигать церебральных структур.

Увеличение амплитуды ранних компонентов ССВП нижних конечностей выражено незначительно. Возможно, это связано с одновременным восстановлением функции других афферентных систем спинного мозга, имеющих реципрок-ные взаимоотношения с проприоцептивной системой. Хорошо известно ингибирующее влияние проприоцептивной импульсации на ноцицептивную чувствительность по механизму воротного контроля. Существует и обратная связь, когда активация ноцицептивных нервных волокон снижает пропускную способность проприоцептивных путей [12]. Правомерность этого предположения покажут дальнейшие исследования с применением методики ноцицептивных вызванных потенциалов, в настоящее время находящейся в стадии разработки.

Изменения амплитуды могут быть нелинейными. В ряде случаев наблюдался двухфазный характер изменения амплитуды: уменьшение амплитуды ранних компонентов во втором исследовании (через 3 месяца от начала клеточной терапии] и сравнительно большее увеличение амплитуды в следующие 6 месяцев. В последующих записях происходила стабилизация достигнутого эффекта или дальнейшее увеличение амплитуды. Можно предположить, что первоначальная негативная девиация является пролонгированным следовым эффектом, связанным с процедурой получения клеток. Дальнейшее изучение этого явления необходимо для понимания его патофизиологических механизмов. В любом случае, возможность ухудшения показателей ССВП в сроки 3-6 месяцев после лечения необходимо учитывать при планировании повторных исследований ССВП и при оценке их результатов.

Уменьшение латентности ранних компонентов было характерно для ССВП нижних конечностей. В записях, сделанных до начала лечения, средняя латентность Р38 в ССВП нижних конечностей составляла 47,93+4,28 мс, N20 в ССВП верхних конечностей - 19,99±1,63 мс (В.В. Гнездицкий [11 ] приводит следующие нормативные данные: 38,3+3,3 и 18,9±1,0 соответственно]. То есть, изначально латентность ранних компонентов ССВП верхних конечностей незначительно отличалась от нормативных данных. Это объясняется тем фактом, что часть активируемых волокон при стимуляции срединного нерва (С5-Т8) вступает в спинной мозг выше уровня повреждения, что определяет формирование первого пика ССВП нормальной латентности. В ССВП нижних конечностей ситуация иная: средняя латентность изначально была увеличена почти на 10 мс, по сравнению с нормативными данными. После 1 -1,5 года клеточной терапии она уменьшилась в среднем на 1,95 мс.

Уменьшение латентности указывает на увеличение скорости прохождения нервного импульса. Традиционно, скорость распространения возбуждения в нервных структурах считается маркером состоятельности миелиновой оболочки [11 -13]. Таким образом, увеличение скорости может свидетельствовать в пользу происходящей ремиелинизации нервных волокон, являющейся, вероятно, одним из результатов деятельности стволовых клеток. Дополнительное исследование ССВП локтевого нерва [С8-Т1] у пациентов с уровнем повреждения выше С7 могло бы уточнить уровень, на котором преимущественно происходят процессы ремиелинизации: на уровне травмы или в нижележащих отделах спинного мозга.

В стандартном варианте ССВП проводится анализ только ранних компонентов [5, 6, 11, 1 3]. Однако, изучение поздних потенциалов также может иметь важное значение при диагностике спинальной травмы. Эти потенциалы наблюдались в значительном числе случаев до лечения при отсутствии ранних компонентов. Ни у одного больного ранние компоненты не наблюдались в отсутствие поздних компонентов. Появлению ранних компонентов во время лечения всегда предшествовало наличие поздних компонентов в первоначальных записях. Следовательно, наличие поздних компонентов может быть одним из предикторов восстановления ранних компонентов ССВП.

У одного из пациентов поздние компоненты появились в процессе лечения. Появления ранних компонентов при этом не отмечалось. Однако наблюдалась стабильная динамика в виде постепенного уменьшения латентности этих компонентов (от 425 мс до 284 мс). В ряде случаев нам приходилось наблюдать резкое увеличение амплитуды поздних потенциалов в процессе лечения. Неясно, следует ли расценивать подобные изменения как позитивный признак.

В настоящее время происхождение и функциональная значимость поздних компонентов ССВП до конца не выяснены. Есть основания предполагать, что поздние компоненты ССВП отражают активацию ноцицептивных систем (вследствие возбуждения тонких, миелинизированных А-дельта и немиелинизированных С волокон периферического нерва) [14-17]. Дальнейшиее сопоставление данных ССВП и ноцицептивных вызванных потенциалов необходимо для установления природы поздних потенциалов и их клинической значимости у больных с ТБСМ и, в частности, при проведении клеточной терапии ТБСМ.

Заключение

Таким образом, впервые в серии исследований ССВП была продемонстрирована динамика изменений паттерна ССВП при клеточной терапии хронической травматической болезни спинного мозга. Изменения параметров ранних компонентов ССВП указывают на улучшение функции спи-нальных путей проприоцептивной чувствительности. При этом отмечаются как признаки увеличения количества эффективно функционирующих аксонов, так и признаки реми-елинизации действующих аксонов. Признаков ухудшения функции спинальных проводников не отмечалось ни у одного больного.

Показана важность изучения поздних компонентов ССВП при клеточной терапии больных ТБСМ. Наличие поздних компонентов, даже низкоамплитудных, является благоприятным прогностическим фактором восстановления путей проприоцептивной чувствительности. Описан феномен поздних потенциалов, возникающих в процессе терапии у больных с изначальным отсутствием ССВП. Требуются дальнейшие исследования для выяснения природы и функциональной значимости этого феномена. Обоснована необходимость исследования ноцицептивных вызванных потенциалов для понимания механизмов действия стволовых клеток на структуры спинного мозга.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Lim P., Tow A. Recovery and Regeneration after Spinal Cord Injury: A Review and Summary of Recent Literature. Ann. Acad. Med. Singapore 2007; 36:49-57

2. Зайцев А.Ю., Красавин И,В., Брюховецкий А.С. и др. Динамика клинико-электронейромиографических показателей у пациентов с хроническим повреждением спинного мозга при лечении аутогенными гемопоэтическими стволовыми клетками. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; 35.

3. Cohen M.E., Sheehan T.P., Herbison G J. Content Validity and Reliability of the International Standarts for Neurological Classification of Spinal Cord Injury. Top Spinal Cord Inj. Rehabil. 1996; 1:15-31.

4. Hayes K.C., Wolfe D.L, Hsieh J.T. et al. Clinical and electrophysiologic correlates of quantitative sensory testing in patients with incomplete spinal cord injury. Arch. Physical Med. Rehabil. 2002; 83[11 ]: 1612 9.

5. Curt A., Dietz V. Electrophysiological recordings in patients with spinal cord injury: significance for predicting outcome. Spinal Cord 1999; 37: 1 57 -65.

6. Iseli E., Cavigelli A., Dietz V.. Curt A. Prognosis and recovery in ischaemic and traumatic spinal cord injury: clinical and electrophysiological evaluation. J. Neurol., Neurosurg., Psych. 1999:67:567 71.

7. Moviglia G.A., Fernandez R., Brizuela J.A. et al. Shuster Combined protocol of cell therapy for chronic spinal cord injury. Report on the electrical and functional recovery of two patients. Cytother. 2006; 8(3): 202-9.

8. Knoller N.. Auerbach G., Fulga V. et al. Clinical experience using incubated autologous macrophages as a treatment for complete spinal cord injury: phase I study results. J. Neurosurg. Spine 2005; 3(3); 173- 81.

9. Sykova E. Homola A., Mazanec R. et al. Autologous bone marrow transplantation in patients with subacute and chronic spinal cord injury. Cell Transpl. 2006; 1 5(8-9): 675-87.

10. Recommendations for the Practice of Clinical Neurophysiology. Edited by G. Deuschl and A. Eisen. Elsevier. 1999.

11. Гнездицкий В.В. Вызванные потенциалы мозга в клинической практике. Таганрог: ТРТУ, 1997.

12. Зенков Л.Р., Ронкин М.А. Функциональная диагностика нервных болезней. М.: Медпресс-информ, 2004.

13. Нейрофизиологические исследования в клинике. Под ред. Щекутьева ГА М.: Антидор, 2001.

14. Соколова А.А., Лившитц А.В. Сравнительная оценка ВП в ответ на болевую и соматосенсорную стимуляцию у человека. Физиология человека 1985:734-42,

15. Bromm В., Treede R.D. Laser-evoked cerebral potentials in the assessment of cutaneous pain sensitivity in normal subjects and patients. Rev. Neurol. (Paris) 1991;147: 625-43.

16. Торопина Г.Г., Егоров О.Е., Яхно Н.Н. Нейрофизиологические корреляты боли и чувствительных расстройств у больных сирингомиелией. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова 2004; 104(3): 42-51.

17. Treede R.D., Lankers J., Frieling A. et al. Cerebral potentials evoked by painful, laser stimuli in patients with syringomyelia. Brain 1991; 114:1595-607.